人原代細胞的解凍方法

 人原代細胞是直接從組織中分離出來的細胞，包括外周血、臍帶血和骨髓。這些細胞因其在生物過程、疾病進展和藥物開發(fā)研究以及包括基于體外細胞的分析或創(chuàng)建異種移植或人源化小鼠模型在內的應用中的重要性而日益受到認可。
如果不需要立即使用，新鮮的原代細胞通常會低溫保存（即冷凍），以便在液氮中長期儲存。處理新鮮樣品資源有限的研究人員也可以 購買冷凍的即用型原代細胞，包括單核細胞 (MNC)、純化的免疫細胞或造血干細胞。解凍冷凍細胞時，正確的技術和處理可確保細胞在下游應用中的活力、恢復和功能。如何解凍冷凍的原代細胞?
一、實驗前準備：
1. 添加了 10% 胎牛血清 (FBS)的 改良培養(yǎng)基（IMDM）
2. DMEM 含 4500 mg/L D-葡萄糖，添加了 10% FBS
3. RPMI 1640 培養(yǎng)基，添加了 10% FBS
4. 含 2% FBS 的磷酸鹽緩沖鹽水（例如含 2% 胎牛血清的磷酸鹽緩沖鹽）
5. 2 mL 血清移液管（例如nest 血清移液器，2 mL）
6. 25 mL 血清移液管（例如nest 血清移液管，25 mL）
7. 50 mL 錐形管（例如 nest離心管，50 mL）
8. DNase I 溶液 (1 mg/mL)（天根試劑）
9. 細胞計數儀（博大博聚）
10. 臺盼藍（索萊寶）
11. 移液器（瑞寧移液槍，rainin電動助吸器）
12. 移液器吸頭（瑞寧，耐思）
13. 人原代細胞
注意事項：
 在 37°C 水浴鍋中加熱培養(yǎng)基。如果解凍細胞用于下游細胞分離，可以使用含有 2% FBS 的 PBS。
 從儲存中取出冷凍細胞時，重要的是盡量減少暴露于室溫 (15 - 25°C)。如果不直接進行解凍，請將細胞置于干冰或液氮容器中。
二、解凍細胞
注意：建議一次只解凍一個冷凍細胞小瓶，以防止在較高溫度下長時間暴露于 DMSO。
2.可 用 70% 乙醇或異丙醇擦拭細胞瓶的外部。
 3.在生物安全柜中，將蓋子擰四分之一圈以釋放內部壓力，然后重新擰緊。
 輕輕旋轉小瓶，在 37°C 水浴中快速解凍細胞。當仍有少量冰時，取出小瓶。這大約需要 1 - 2 分鐘。
三、細胞洗滌和計數
注意：重要的是在以下步驟中快速工作以確保高細胞活力和恢復。
 用 70% 乙醇或異丙醇再次擦拭小瓶的外部。
 在生物安全柜中，使用 2 mL 血清移液器測量細胞懸浮液的總體積。該值在步驟 13 中用于計算提供的單元格總數。將細胞放回小瓶中以混合懸浮液。
 取出 20 μL 等分的細胞進行計數。如果使用臺盼藍評估活力，對于 ≥ 1 x 10 6 個細胞，至少添加 20 µL 培養(yǎng)基并記錄添加的培養(yǎng)基體積。對于 < 1 x 10 6 個細胞，直接用 20 µL 臺盼藍稀釋。將稀釋的等分試樣放在一邊，直到第 13 步。
重要提示：必須對解凍后（洗滌前）立即收集的等分試樣進行活細胞計數。這將確認提供的細胞數量，并跟蹤洗滌過程中潛在的細胞損失。在洗滌步驟中，預計細胞損失高達 30%。

•  使用移液器將剩余的細胞懸浮液轉移到 50 mL 錐形管中。

•  用 1 mL 培養(yǎng)基沖洗小瓶并將其逐滴添加到細胞中，同時輕輕旋轉 50 mL 管。

•  通過逐滴添加 15-20 mL 的介質進行清洗，同時輕輕旋轉管子。

• 在室溫 (15 - 25°C) 下 以 300 x g 離心細胞懸液10 分鐘。

•  如果使用臺盼藍，對第 8 步稀釋的等分試樣進行細胞計數。

•  用移液器小心地去除上清液，留下少量培養(yǎng)基以確保細胞沉淀不受干擾。輕輕彈動試管重懸細胞沉淀。

•  如果細胞開始結塊，每毫升細胞懸浮液加入 100 µg DNase I 溶液，并在室溫下孵育 15 分鐘。

注意：如果細胞將用于 DNA 或 RNA 提取，請勿添加 DNase I 溶液。

•  輕輕地將 15-20 mL 的介質添加到管中。

• 在室溫下 以 300 x g 離心細胞懸液10 分鐘。

•  用移液器小心去除上清液，留下少量培養(yǎng)基以確保細胞沉淀不受干擾。輕輕彈動試管重懸細胞沉淀。

   解凍后的 細胞即可用于下游應用。
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