本文主要介紹 4種 Transwell實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟，具體包括：Transwell 腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、Transwell 上皮細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、Transwell B16 細(xì)胞的體外遷移實(shí)驗(yàn)、Transwell內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1遷移實(shí)驗(yàn)。
一、Transwell腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
過(guò)程與Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)基本一致，不同的只是不需要鋪Matrigel。由于沒有基質(zhì)膠的阻擋，細(xì)胞穿過(guò)膜的速度較侵襲實(shí)驗(yàn)明顯加快，所以細(xì)胞量要更大。我做侵襲實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞密度是1×10°，而遷移實(shí)驗(yàn)的密度是1×10°。另外，下層培養(yǎng)液的FBS濃度也可適當(dāng)下調(diào)，侵襲實(shí)驗(yàn)的濃度是5%，遷移實(shí)驗(yàn)的濃度是2.5%。
二、Transwell上皮細(xì)胞培養(yǎng)
1.將雄性 wistar大鼠麻醉，開胸，將氣管取出，置于4℃含0.1%胰蛋白酶XIV、100 U/mL青霉素和100ug/mL鏈霉素、無(wú)Ca2t、無(wú)Mg2t、無(wú)血清的MEM。
2.用無(wú)菌的細(xì)胞刮棒刮氣管內(nèi)壁，將所得溶液離心后得到游離細(xì)胞。
 
3.離心后立即用新鮮的上述 MEM溶液（含10%胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的LHC-8 medium 沖洗一次。
4.沖洗過(guò)后，將得到的細(xì)胞懸液用臺(tái)盼蘭測(cè)定活力，若存活率大于 90%，則將細(xì)胞以10°/cm2密度接種于可通透的多聚碳濾膜上（12mm），以37°C，5%CO2-95%空氣，含5%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素的LHC-8medium 孵育6~10天。
5. 孵育后，經(jīng)測(cè)定跨上皮電阻在1000-2000Q之間，即可用于電生理試驗(yàn)。顯微鏡下氣管上皮細(xì)胞形細(xì)胞呈鋪路石狀，圓形核位于中央，生長(zhǎng)時(shí)常彼此緊密連接成單層細(xì)胞片。
三、Transwell B16細(xì)胞的體外遷移實(shí)驗(yàn)
把 Transwell 倒置，在 Transwell 的 PVPF 膜（0.8μm）的下表面涂一層fibronectin（10 μg/mL，50μL），37 度 2小時(shí)，PBS 洗一遍后，放入預(yù)先每孔加有600μL的培養(yǎng)基（含10%血清）的24孔板內(nèi)，后在Transwell的內(nèi)室加入細(xì)胞（100μL，用含0.1%血清的培養(yǎng)基稀釋好自己所需密度），放入培養(yǎng)箱，12-18小時(shí)后，取出Transwell，用棉簽擦去PVPF膜靠近內(nèi)室那一面的細(xì)胞，另一面的細(xì)胞用甲醛室溫固定30分鐘，結(jié)晶紫染色20分鐘，用清水洗3遍以上，后在顯微鏡下觀察細(xì)胞，記數(shù)。
 
四、內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1遷移實(shí)驗(yàn)
    1%明膠處理的Transwell經(jīng)無(wú)血清的MCDB131培液于培養(yǎng)箱中平衡1小時(shí)后上室加入 100μL 用serum-free MCDB131稀釋的5×104/孔的HMEC及不同濃度的藥物，下室加入0.6mL serum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激遷移同時(shí)設(shè)置相應(yīng)陰性及陽(yáng)性對(duì)照，置于COa培養(yǎng)箱中作用8小時(shí)，然后棄去孔中培液，用90%酒精常溫固定30分鐘，0.1%結(jié)晶紫常溫染色10分鐘，清水漂凈，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，顯微鏡下觀察并拍照，最后用10%乙酸100μL/孔抽提10分鐘，于600nm處測(cè)定OD值。抑制率計(jì)算公式為：抑制率（%）=【（OD 值給藥組-OD值無(wú)刺激陰性對(duì)照）/（OD值不加藥陽(yáng)性對(duì)照-OD值無(wú)刺激陰性對(duì)照）×100%。
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