免疫組化實驗步驟及常見問題分析

免疫組化實驗流程
 
1.樣品制備
 
2.組織固定：根據(jù)要求收集人或動物的組織用于IHC分析，沖洗并用固定劑（一般用甲醛）進(jìn)行固定
 
3.組織包埋：將經(jīng)甲醛固定的組織嵌入石蠟，以長期保持其天然形狀和組織結(jié)構(gòu)
 
4.切片安裝：將組織樣品在切片機(jī)上切片，并轉(zhuǎn)移至載玻片上干燥保持其形態(tài)
 
5.脫蠟水化：因切片上的石蠟會妨礙染色，所以需將切片上的石蠟溶出，并水化。脫蠟或水化不全容易造成非特異性背景著色（一般的脫蠟水化步驟是：將切片依次浸入二甲苯Ⅰ10min-二甲苯Ⅱ10min-無水乙醇5min-95%無水乙醇5min-90%無水乙醇5min-80%無水乙醇5min-70%無水乙醇5min-50%無水乙醇5min-蒸餾水5min×3，進(jìn)行脫蠟水化）。
 
6.抗原修復(fù)：由于組織在甲醛固定過程中，蛋白之間發(fā)生了交聯(lián)及醛基的封閉從而掩蓋抗原決定簇。可以通過高壓加熱修復(fù)抗原，使細(xì)胞內(nèi)抗原決定族暴露，從而提高抗原檢測率。
 
7.非特定位點封閉：為了防止一抗的非特異性結(jié)合造成假陽性，可以選用BSA、羊血清等封閉非特異性結(jié)合位點。封閉血清來源一般與二抗保持一致，室溫封閉10-30min。
 
8.樣品染色
 
一抗、二抗孵育：抗體孵育時間、溫度及濃度等因素對染色結(jié)果都存在很大影響。在4℃下反應(yīng)緩慢，背景較淺；37℃反應(yīng)較快時間較短；而室溫介于兩者之間，選擇室溫有利于實驗的進(jìn)行。二抗一般室溫孵育30min。
 
底物顯色：基于與酶綴合的二抗，抗原通過生色或熒光方式直接檢測。
 
復(fù)染封片：組化染色后進(jìn)行復(fù)染可以襯托出組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，常用的復(fù)染劑有蘇木精、曙紅、甲基綠、DAPI和Hoechst熒光染色。觀察結(jié)束后使用中性樹膠進(jìn)行封片，可以長久保存。
 

免疫組化實驗常見問題分析

 
 
1. IHC實驗結(jié)果顯色過深
 
一抗?jié)舛冗^高或孵育時間過長——降低一抗?jié)舛然驕p少孵育時間
 
孵育溫度過高——選擇4℃或室溫孵育
 
2. 實驗結(jié)果存在非特異性顯色
 
石蠟切片脫蠟不夠——延長脫蠟時間
 
蛋白封閉不充分——增加蛋白封閉時間
 
組織富含內(nèi)源性生物素與過氧化物酶——使用相關(guān)試劑進(jìn)行封閉
 
3. 實驗結(jié)果顯色弱或無染色
 
一抗?jié)舛冗^低或孵育時間過短——增加一抗?jié)舛然蜓娱L孵育時間
 
組織中無目的抗原的表達(dá)：一抗種屬來源與二抗不匹配
 
免疫組化實驗注意事項
 
切片脫蠟和水化要充分，加反應(yīng)液時要覆蓋組織充分；每次加液前甩干洗滌液，同時防止干片。
 
一抗的沖洗原則：單獨沖洗，防交叉反應(yīng)污染；溫柔沖洗，防止切片脫落；可采用浸洗方式。
 

有條件的話立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。

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