樣品制備原則

樣品制備是雙向電泳中最關(guān)鍵的一步，將直接影響 2-DE 結(jié)果好壞。目前并 沒有一個(gè)通用的樣品制備方法， 盡管處理方法多種多樣， 但都遵循幾個(gè)基本的原 則： 1）盡可能的提高樣品蛋白的溶解度，抽提最大量的總蛋白，減少蛋白質(zhì)的 損失； 2）減少對(duì)蛋白質(zhì)的人為修飾； 3）破壞蛋白質(zhì)與其他生物大分子的相互作

用，并使蛋白質(zhì)處于變性狀態(tài)。

根據(jù)這一原則，樣品制備需要四種主要的試劑：離液劑(chaotropes), 主要包 括尿素（Urea）和硫脲（thiourea ）；表面活性劑（sufactants），也稱去垢劑，

如 CHAPS 與 Zwittergent 系列等雙性離子去垢劑；還原劑（reducing agents），常用的是二硫蘇糖醇（DTT）和磷酸三丁酯（TBP）等。當(dāng)然，也可以選擇性 的加入 Tris-base, 蛋白酶抑制劑以及核酸酶。樣品的來源不同，其裂解的緩沖液也各不相同。通過不同試劑的合理組合， 以達(dá)到對(duì)樣品蛋白的最大抽提。在對(duì)樣品蛋白質(zhì)提取的過程中， 必須考慮到去除 影響蛋白質(zhì)可溶性和 2DE 重復(fù)性的物質(zhì)，比如核酸、脂、多糖等大分子以及鹽  類小分子。大分子的存在會(huì)阻塞凝膠孔徑，鹽濃度過高會(huì)降低等電聚焦的電壓， 甚至?xí)p壞 IPG 膠條，這樣都會(huì)造成 2-DE 的失敗。樣品制備的失敗很難通過后

續(xù)工作的完善或改進(jìn)獲得補(bǔ)償。

核酸的去除可采用超聲或核酸酶處理， 超聲處理應(yīng)控制好條件， 并防止產(chǎn)生 泡沫； 而加入的外源核酸酶則會(huì)出現(xiàn)在最終的 2D 膠上。脂類和多糖都可以通過 超速離心除去。透析可以降低鹽濃度， 但時(shí)間太長(zhǎng)； 也可以采取凝膠過濾或沉淀 /重懸法脫鹽，但會(huì)造成蛋白質(zhì)的部分損失。

因此， 樣品制備方法必須根據(jù)不同的樣品、所處的狀態(tài)以及實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?nbsp;來進(jìn)行選擇。 目前有很多方法適于 2-DE，如組織或細(xì)胞的總蛋白提取物、亞細(xì) 胞組份或細(xì)胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亞組份蛋白（如磷酸化蛋白、 采用 親合純化凝集素結(jié)合蛋白等）。

一、細(xì)胞樣品

1.    細(xì)胞培養(yǎng)，加藥與處理。

2.    胰酶消化貼壁細(xì)胞， PBS 漂洗 3 次(1500g, 5min) ，棄上清,  再次離心，去 盡殘液（ 非常重要?。Ｈ缫容^細(xì)胞膜蛋白組的差別， 最好用細(xì)胞刮收獲細(xì) 胞。如用 10mM Tris/ 250 mM Sucrose(pH 7.0)代替 PBS，可有效降低樣品的 鹽濃度。加入 5 倍體積裂解液，混勻（或?qū)?nbsp;1× 106  細(xì)胞懸于 60 ～ 100µl 裂解液 中 ）。 

3.    加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml Dnase ，在 4℃放置 15 分鐘。

4.    15,000 轉(zhuǎn)， 4℃離心 60 分鐘（或 40,000 轉(zhuǎn)， 4℃離心 30 分鐘 ）。 

5.    收集上清。

6.    測(cè)定蛋白濃度(采用 BioRad RC/DC protein assay kit)。

7.    分裝樣品，凍存于－70℃。

二、組織樣品

1.   碾缽碾磨組織，碾至粉末狀。

2.   將適量粉末狀組織轉(zhuǎn)移至勻漿器，加入適量裂解液，進(jìn)行勻漿。

3.   加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml DNase，在 4℃放置 15 分鐘。

4.   15,000 轉(zhuǎn)， 4℃離心 60 分鐘（或 40,000 轉(zhuǎn)， 4℃離心 30 分鐘 ）。 

5.   收集上清，測(cè)定蛋白濃度。

6.    分裝樣品，凍存于－70℃。

注意事項(xiàng)：

1.   8 mmol/L PMSF 必須在添加還原劑之前用，否則 PMSF 會(huì)失去活性。 

2.  40 mmol/L 濃度以下的 Tris 可使有些蛋白酶在高 pH 值下失活。

3.   細(xì)胞清洗―― 大多用 PBS，若 PBS 殘留于細(xì)胞表面會(huì)造成膠上出現(xiàn)水平條紋 ，

則可利用(10 mmol/LTris, 250 mmol/L sucrose pH 7.0)來解決此問題。 

雙向電泳操作步驟

水化上樣(被動(dòng)上樣)

1.    從冰箱中取出 IPG 膠條，室溫放置 10min。

2.    沿水化盤槽的邊緣從左向右線性加入樣品，槽兩端各 1cm 左右不加樣，中間 的樣品液一定要連貫.注意：不要產(chǎn)生氣泡， 否則會(huì)影響膠條中蛋白質(zhì)的分布。

3.    用鑷子輕輕撕去 IPG 膠條上的保護(hù)層。 注意：堿性端較脆弱，應(yīng)小心操作。

4.    將IPG 膠條膠面朝下輕輕置于水化盤中樣品溶液上.注意:不要將樣品溶液弄到 膠條背面, 因?yàn)檫@些溶液不會(huì)被膠條吸收;還使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如產(chǎn) 生了氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動(dòng)膠條，直到氣泡被趕走。

5.    放置 30~45min 大部分樣品被膠條吸收， 沿著膠條緩慢加入礦物油， 每根膠條

約 3ml(17cm IPG)，防止膠條水化過程中液體蒸發(fā)。

6.    置等電聚焦儀于-20℃水化 11~15h。

一向 等電聚焦

1.    將紙電極置于聚焦盤的正負(fù)極上，加 ddH2O 5~8µl 潤(rùn)濕。

2.    取出水化好的膠條，提起一端將礦物油瀝干，膠面朝下，將其置于剛好潤(rùn)濕 的濾紙片上雜交以去除表面上的不溶物。

3.    將 IPG 膠條膠面朝下置于聚焦盤中， 膠條的正極（標(biāo)有+ ）對(duì)應(yīng)于聚焦盤的正極，確保膠條與電極緊密接觸。

4.    在每根膠條上覆蓋 2-3ml 礦物油。

5.    對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序。

6.    聚焦結(jié)束的膠條，立即進(jìn)行平衡、第二向 SDS-PAGE 電泳?；?qū)⒛z條置于樣

品水化盤中， -20℃冰箱保存， 電泳前取出膠條， 室溫放置 10 分鐘， 使其溶解。

第二向 SDS-PAGE 電泳

1.    配制 12%的丙烯酰胺凝膠。

2.    待凝膠凝固后， 倒去分離膠表面的 MilliQ  水、乙醇或水飽和正丁醇， 用MilliQ 水沖洗。

3.    配制膠條平衡緩沖液 I

4.    在桌上先放置干的厚濾紙， 聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另 一份厚濾紙用 MilliQ 水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸 干膠條上的礦物油及多余樣品，這樣可以減少凝膠染色時(shí)出現(xiàn)的縱條紋。

5.    將膠條轉(zhuǎn)移至樣品水化盤中，加入 6ml(17cm IPG)平衡緩沖液 I，在水平搖床 上緩慢搖晃 15 分鐘。

6.    配制膠條平衡緩沖液 II。

7.    第一次平衡結(jié)束后，取出膠條將之豎在濾紙上瀝去多余的液體，放入平衡緩 沖液 II 中，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃 15 分鐘。

8.    用濾紙吸去 SDS-PAGE 膠上方玻璃板間多余的液體， 將二向凝膠放在桌面上，

凝膠的頂部面對(duì)自己。

9.    將瓊脂糖封膠液加熱溶解。

10.  在 100ml 量筒中加入 TGS 電泳緩沖液。

11.  第二次平衡結(jié)束后，取出膠條，用濾紙吸去多余的平衡液（將膠條豎在濾紙 上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。

12.  用鑷子夾住膠條的一端使膠面全浸末在 1× 電泳緩沖液中漂洗數(shù)次。

13.  將膠條背面朝向玻璃板，輕輕放在長(zhǎng)玻板上，加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液。

14.  用適當(dāng)厚度的膠片, 輕輕地將膠條向下推,使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面全接 觸.注意:不要在膠條下方產(chǎn)生氣泡， 應(yīng)推動(dòng)凝膠背面的支撐膜， 不要碰到膠面。

15.  放置 5 分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液凝固。

16.  打開二向電泳制冷儀，調(diào)溫度為 15℃。

17.  將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中，加入電泳緩沖液，接通電源，起始時(shí)用的低電流 （5mA~10mA/gel/17cm ），待樣品在全走出 IPG 膠條， 濃縮成一條線后， 再 加 大 電流（20-30mA/gel/17cm ）待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。

 18.  電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號(hào)（戴手套，防止污染膠面）。

19.  進(jìn)行染色。

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