在生物醫(yī)學研究領(lǐng)域，類器官正憑借其優(yōu)勢改變著科研格局。作為由干細胞或多能干細胞經(jīng)三維培養(yǎng)形成的微型組織模型，類器官能高度模擬體內(nèi)器官的結(jié)構(gòu)與功能，在疾病建模、精準醫(yī)學、藥物篩選及再生醫(yī)學等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大應用潛力。比如肝細胞類器官為肝臟移植提供了新平臺，呼吸道類器官還成功實現(xiàn)了人鼻病毒 C 的連續(xù)傳代培養(yǎng)，解決了傳統(tǒng)細胞系中難以培養(yǎng)該病毒的難題。

相較于傳統(tǒng) 2D 細胞培養(yǎng)無法模擬組織微環(huán)境、動物模型存在物種差異及倫理限制的局限性，類器官在保留組織異質(zhì)性、維持基因組穩(wěn)定性方面優(yōu)勢較高，被視作替代傳統(tǒng)模型的 “活體生物庫"。但類器官技術(shù)的廣泛應用，卻受限于長期培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵瓶頸 —— 傳代操作。傳代是維持類器官持續(xù)擴增與功能穩(wěn)定的核心環(huán)節(jié)，其效率直接決定實驗的可重復性與研究進展。

當前，像肝癌、甲狀腺癌這類難養(yǎng)類器官，在傳代過程中普遍面臨活性不足、結(jié)構(gòu)破壞等問題，有數(shù)據(jù)顯示肝癌類器官傳代后存活率不足 40%，導致這類模型難以用于長期實驗研究。此外，傳代過程中細胞存活率低、增殖效率差等問題，也制約著胰腺癌等疾病模型的研究進程，優(yōu)化傳代技術(shù)已迫在眉睫。

傳代技術(shù)的核心挑戰(zhàn)主要體現(xiàn)在三個方面：一是機械或酶解分離容易破壞類器官結(jié)構(gòu)完整性；二是消化時間與力度控制不當會導致細胞活性下降；三是傳代后基質(zhì)包埋與培養(yǎng)條件適配性不足，影響后續(xù)增殖效率。這些問題在干細胞來源的復雜類器官（如肝 / 胰腺共祖細胞衍生模型）中更為突出，直接限制了其從基礎(chǔ)研究向臨床轉(zhuǎn)化的應用。

基于此，深入分析類器官傳代的關(guān)鍵技術(shù)節(jié)點，建立標準化操作流程，提供試劑盒選擇的科學依據(jù)，探討技術(shù)優(yōu)化路徑，對于解決難養(yǎng)類器官傳代困境、推動類器官技術(shù)在精準醫(yī)學與再生醫(yī)學領(lǐng)域的規(guī)范化應用具有重要意義。

一、類器官傳代效率提升關(guān)鍵技術(shù)點

想要提升類器官傳代效率，需精準把控消化、離心、基質(zhì)膠處理等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，具體技術(shù)要點如下：

• 消化體系：采用機械分散與酶解結(jié)合的方式，先通過 200μm 濾網(wǎng)過濾進行機械分散，再用 0.25% Trypsin-EDTA 在 37℃條件下孵育 5 分鐘，實現(xiàn)類器官的有效分離。

• 離心條件：使用 4℃預冷的離心機，以 200×g 的轉(zhuǎn)速離心 5 分鐘，離心完成后棄去上清液，用培養(yǎng)基重懸沉淀，保留細胞活性。

• 基質(zhì)膠處理：基質(zhì)膠需在冰上融化，之后與細胞懸液按 1:3 的體積比混合，同時要確保每孔接種密度達到 5×10?個細胞，為類器官后續(xù)生長提供良好基礎(chǔ)。

二、類器官傳代技術(shù)的研究進展

類器官傳代技術(shù)的發(fā)展，見證了 3D 細胞培養(yǎng)從依賴經(jīng)驗到標準化、精準化的轉(zhuǎn)變。早期傳代操作高度依賴研究者經(jīng)驗，比如用手動刮除基質(zhì)膠的物理分離方式，容易造成細胞機械損傷；酶消化時間僅靠肉眼判斷，主觀性強，常出現(xiàn)消化過度或不充分的情況，直接影響細胞存活率與類器官結(jié)構(gòu)完整性。這種粗放式操作導致不同實驗室、甚至同一實驗室不同批次的傳代結(jié)果差異明顯，嚴重制約了類器官技術(shù)的可重復性與轉(zhuǎn)化進程。

（一）技術(shù)突破：從流程優(yōu)化到體系創(chuàng)新

近五年，類器官傳代技術(shù)在標準化與效率提升方面取得多項關(guān)鍵突破，形成了多維度的技術(shù)革新：

1. 標準化操作體系構(gòu)建：消化酶與傳代參數(shù)的優(yōu)化是流程標準化的核心。TrypLE™系列等胰蛋白酶替代產(chǎn)品，憑借更溫和的酶解特性，大幅降低了傳統(tǒng)胰酶對細胞表面受體的破壞；傳代比例控制（1:2-1:4）與機械分散技術(shù)結(jié)合，實現(xiàn)了腸道、肝等常規(guī)類器官的穩(wěn)定傳代。此外，食管類器官還建立起包含 Dispase 消化、胰蛋白酶解離及 40μm 過濾器過濾的三步標準化流程，將原代組織的傳代成功率提升至 85% 以上。

2. 無基質(zhì)膠培養(yǎng)與水凝膠體系革新：同濟大學開發(fā)的 BEX 擴增體系打破了傳統(tǒng)基質(zhì)膠的限制，該體系通過 5-DPM 培養(yǎng)基（含 RG108、A83-01、毛喉素等小分子抑制劑與 RSPO1 生長因子）與 HAHS 水凝膠的組合，實現(xiàn)了膽管類器官在 60 天內(nèi) 3000 倍擴增，且可穩(wěn)定傳代 20 代以上。通過成分確定的化學微環(huán)境調(diào)控，該體系避免了基質(zhì)膠批次差異帶來的干擾，為膽管疾病建模與藥物篩選提供了穩(wěn)定的體外模型。

3. 功能維持與精準調(diào)控技術(shù)：日本研究團隊發(fā)現(xiàn)，OSM（Oncostatin M）可通過激活 STAT3 通路，顯著提升肝細胞類器官的代謝功能維持能力，使傳代后細胞的尿素合成與藥物代謝活性保留率提高 40% 以上。在病毒研究領(lǐng)域，呼吸道類器官通過引入 CYT387 抑制干擾素通路，實現(xiàn)人鼻病毒 C 在氣道上皮類器官中的連續(xù) 5 次傳代，而鼻類器官更展現(xiàn)出自發(fā)支持病毒傳代的優(yōu)勢，為呼吸道病毒致病機制研究提供了全新工具。

4. 自動化與專用試劑系統(tǒng)開發(fā)：針對傳代痛點，相關(guān)廠商推出了專用試劑盒，大幅降低了操作門檻。例如含鼠源特異性生長因子的培養(yǎng)基，可精準匹配腸道干細胞的自我更新需求；生物相容性水凝膠凍存試劑，能將類器官凍存復蘇后的存活率提升至 90% 以上。最新研究顯示，通過分群結(jié)構(gòu)分析、時序分群占比密度矩陣構(gòu)建及生長函數(shù)修正的自動化傳代控制系統(tǒng)，可實現(xiàn)傳代時機的精準判斷，使培養(yǎng)效率提升 35%。

（二）傳代方法選擇指南

不同類器官特性不同，適用的傳代方法也存在差異，具體選擇可參考以下指南：

• 碎片傳代：是多數(shù)類器官的重要方法，通過機械吹打獲得 50-200μm 的細胞團塊，既能兼顧細胞活性，又能保留其分化潛力。

• 酶消化法：適用于緊密連接的上皮類器官，常用 Tryple™Express 酶，操作時需嚴格控制消化時間，通常為 5-10 分鐘。

• 單細胞傳代：僅推薦用于克隆培養(yǎng)，且需添加 ROCK 抑制劑，以減少單細胞凋亡。

（三）現(xiàn)存問題：標準化瓶頸與技術(shù)挑戰(zhàn)

盡管類器官傳代技術(shù)迭代迅速，但仍面臨兩大核心挑戰(zhàn)。一方面，傳代參數(shù)缺乏統(tǒng)一標準：肝癌類器官需 1:2 高比例傳代以維持增殖活性，而甲狀腺癌類器官則需 1:4 低比例傳代避免過度擁擠，這種組織特異性差異導致跨實驗室數(shù)據(jù)可比性差。另一方面，試劑盒兼容性不足：現(xiàn)有商用試劑盒多針對腸道、乳腺等常見類器官開發(fā)，對膽管、胰腺等特殊類型類器官的支持度有限，

近年來，國產(chǎn)類器官培養(yǎng)試劑盒也是層出不窮，比如濟研的鼠源類器官一站式構(gòu)建及傳代試劑盒、類器官專用組織包埋膠（SE-Gel）等，采用納米級親水涂層微孔板，支持鼠源類器官懸浮培養(yǎng)，無需基質(zhì)膠包埋，傳代時直接收集細胞球，避免酶解損傷，細胞存活率提升至 90% 以上；傳代后細胞倍增時間縮短至 24-36 小時（傳統(tǒng)培養(yǎng)基需 48-72 小時）；經(jīng) 10 + 種鼠源腫瘤類器官（如胃癌、卵巢癌）傳代驗證，結(jié)構(gòu)完整率達 85% 以上，為后續(xù)標準化流程設(shè)計與試劑盒選擇指南提供了現(xiàn)實依據(jù)。

更多類器官培養(yǎng)試劑，基質(zhì)膠，類器官培養(yǎng)基，試劑盒等實驗耗材請進入蘇州阿爾法生物進行了解。