一、材料、設(shè)備及試劑

（一）材料

含 pBS 的 E. coli DH5α 或 JM 系列菌株，1.5ml 塑料離心管 (又稱 eppendorf 管)，離心管架。

（二）設(shè)備

微量取液器 (20μl,200μl,1000μl)，臺式高速離心機(jī)，恒溫振蕩搖床，高壓蒸汽消毒器 (滅菌鍋)，渦旋振蕩器，電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等。

（三）試劑

1. LB 液體培養(yǎng)基 (Luria-Bertani)：稱取蛋白胨 (Tryptone) 10g，酵母提取物 (Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于 800ml 去離子水中，用 NaOH 調(diào) pH 至 7.5，加去離子水至總體積 1 升，高壓下蒸氣滅菌 20 分鐘。

2. LB 固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中每升加 12g 瓊脂粉，高壓滅菌。

3. 氨芐青霉素 (Ampicillin, Amp) 母液：配成 50mg/ml 水溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4. 溶菌酶溶液：用 10mmol/L Tris?Cl (pH8.0) 溶液配制成 10mg/ml，并分裝成小份 (如 1.5ml) 保存于 - 20℃，每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。

5. 3mol/l NaAc (pH5.2)：50ml 水中溶解 40.81g NaAc?3H2O，用冰醋酸調(diào) pH 至 5.2，加水定容至 100ml，分裝后高壓滅菌，儲存于 4℃冰箱。

6. 溶液 Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl (pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0)。溶液 Ⅰ 可成批配制，每瓶 100ml，高壓滅菌 15 分鐘，儲存于 4℃冰箱。

7. 溶液 Ⅱ：0.2mol/L NaOH (臨用前用 10mol/L NaOH 母液稀釋)，1％SDS。

8. 溶液 Ⅲ：5mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，H2O 28.5ml，定容至 100ml，并高壓滅菌。溶液終濃度為：K+ 3mol/L，Acˉ 5mol/L。

9. RNA 酶 A 母液：將 RNA 酶 A 溶于 10mmol/L Tris?Cl (pH7.5)，15mmol/L NaCl 中，配成 10mg/ml 的溶液，于 100℃加熱 15 分鐘，使混有的 DNA 酶失活。冷卻后用 1.5ml eppendorf 管分裝成小份保存于 - 20℃。

10. 飽和酚：市售酚中含有醌等氧化物，這些產(chǎn)物可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo)致 RNA 和 DNA 的交聯(lián)，應(yīng)在 160℃用冷凝管進(jìn)行重蒸。重蒸酚加入 0.1％的 8 - 羥基喹啉 (作為抗氧化劑)，并用等體積的 0.5mol/L Tris?Cl (pH8.0) 和 0.1mol/L Tris?Cl (pH8.0) 緩沖液反復(fù)抽提使之飽和并使其 pH 值達(dá)到 7.6 以上，因為酸性條件下 DNA 會分配于有機(jī)相。

11. 氯仿：按氯仿：異戊醇＝24:1 體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機(jī)相的分開，異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。按體積 / 體積＝1:1 混合上述飽和酚與氯仿即得酚 / 氯仿 (1:1)。酚和氯仿均有很強(qiáng)的腐蝕性，操作時應(yīng)戴手套。

12. TE 緩沖液：10mmo/L Tris?Cl (pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。高壓滅菌后儲存于 4℃冰箱中。

13. STET：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0)，5% Triton X-100。

14. STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。

15. 電泳所用試劑：（1）TBE 緩沖液 (5×)：稱取 Tris 54g，硼酸 27.5g，并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml，定溶至 1000ml。（2）上樣緩沖液 (6×)：0.25% 溴酚藍(lán)，40% (w/v) 蔗糖水溶液。

二、操作步驟

（一）細(xì)菌的培養(yǎng)和收集

將含有質(zhì)粒 pBS 的 DH5α 菌種接種在 LB 固體培養(yǎng)基 (含 50μg/ml Amp) 中，37℃培養(yǎng) 12-24 小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到 5ml LB 液體培養(yǎng)基 (含 50μg/ml Amp) 中，37℃振蕩培養(yǎng)約 12 小時至對數(shù)生長后期。

（二）質(zhì)粒 DNA 少量快速提取

質(zhì)粒 DNA 小量提取法對于從大量轉(zhuǎn)化子中制備少量部分純化的質(zhì)粒 DNA 十分有用。這些方法共同特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣，所得 DNA 有一定純度，可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。

1. 煮沸法

1. 將 1.5ml 培養(yǎng)液倒入 eppendorf 管中，4℃下 12000ｇ離心 30 秒。

2. 棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。

3. 將菌體沉淀懸浮于 120ml STET 溶液中，渦旋混勻。

4. 加入 10ml 新配制的溶菌酶溶液 (10mg/ml)，渦旋振蕩 3 秒鐘。

5. 將 eppendorf 管放入沸水浴中，50 秒后立即取出。

6. 用微量離心機(jī) 4℃下 12000g 離心 10 分鐘。

7. 用無菌牙簽從 eppendorf 管中去除細(xì)菌碎片。

8. 取 20ml 進(jìn)行電泳檢查。

[注意] 1. 對大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個菌落直接進(jìn)行煮沸法提取質(zhì)粒 DNA。

2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，濃度高時，細(xì)菌裂解效果反而不好。有時不同溶菌酶也能溶菌。

3. 提取的質(zhì)粒 DNA 中會含有 RNA，但 RNA 并不干擾進(jìn)一步實驗，如限制性內(nèi)切酶消化、亞克隆及連接反應(yīng)等。

2. 堿法

1. 取 1.5ml 培養(yǎng)液倒入 1.5ml eppendorf 管中，4℃下 12000g 離心 30 秒。

2. 棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘，使液體流盡。

3. 菌體沉淀重懸浮于 100μl 溶液 Ⅰ 中 (需劇烈振蕩)，室溫下放置 5-10 分鐘。

4. 加入新配制的溶液 Ⅱ200μl，蓋緊管口，快速溫和顛倒 eppendorf 管數(shù)次，以混勻內(nèi)容物 (千萬不要振蕩)，冰浴 5 分鐘。

5. 加入 150μl 預(yù)冷的溶液 Ⅲ，蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩 10 秒，使沉淀混勻，冰浴中 5-10 分鐘，4℃下 12000g 離心 5-10 分鐘。

6. 上清液移入干凈 eppendorf 管中，加入等體積的酚 / 氯仿 (1:1)，振蕩混勻，4℃下 12000g 離心 5 分鐘。

7. 將水相移入干凈 eppendorf 管中，加入 2 倍體積的無水乙醇，振蕩混勻后置于 - 20℃冰箱中 20 分鐘，然后 4℃下 12000g 離心 10 分鐘。

8. 棄上清，將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入 1ml 70％乙醇洗沉淀一次，4℃下 12000g 離心 5-10 分鐘。

9. 吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，真空干燥 10 分鐘或室溫干燥。

10. 將沉淀溶于 20μl TE 緩沖液 (pH8.0，含 20μg/ml RNaseA) 中，儲于 - 20℃冰箱中。

[注意] 1. 提取過程應(yīng)盡量保持低溫。

2. 提取質(zhì)粒 DNA 過程中除去蛋白很重要，采用酚 / 氯仿去除蛋白效果較單獨用酚或氯仿好，要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。

3. 沉淀 DNA 通常使用冰乙醇，在低溫條件下放置時間稍長可使 DNA 沉淀。沉淀 DNA 也可用異丙醇 (一般使用等體積)，且沉淀全，速度快，但常把鹽沉淀下來，所以多數(shù)還是用乙醇。

3. Wizard 少量 DNA 純化系統(tǒng)

Promega 公司的 Wizard 少量 DNA 純化系統(tǒng)可快速有效的抽提質(zhì)粒 DNA，整個過程只需 15 分鐘。提取的質(zhì)?？芍苯佑糜?DNA 測序、酶切分析和體外轉(zhuǎn)錄等。

該系統(tǒng)中所含試劑和柱子可以用于 50 次 1-3ml 質(zhì)粒培養(yǎng)液的分離和純化，試劑包括 10ml 細(xì)胞懸浮液，10ml 細(xì)胞裂解液；10ml 中和液，50ml Wizard 少量 DNA 純化樹脂，50ml 柱洗液（使用前加 95% 乙醇至 120ml) 和 50 支 Wizard 微型柱。

1. 1-3ml 過夜培養(yǎng)細(xì)胞液 4℃下 12000g 離心 1-2 分鐘。

2. 去除上清液，菌體細(xì)胞懸浮于 200μl 細(xì)胞懸浮液中，充分混合，并移入 eppendorf 管中。

3. 加 200μl 細(xì)胞裂解液，顛倒離心管數(shù)次，直到溶液變清亮。

4. 加 200μl 中和液，顛倒離心管數(shù)次。

5. 4℃下 12000g 離心 5 分鐘，取上清液于新的 eppendorf 管中。

6. 加 1ml Wizard 少量 DNA 純化樹脂，顛倒離心管數(shù)次以充分混勻。

7. 取一次性注射器，取出注塞，并使注射筒與 Wizard 微型柱連接，用移液槍將上述混合液加入注射筒中，并用注塞輕推，使混合物進(jìn)入微型柱。

8. 將注射器與微型柱分開，取出注塞，再將注射筒與微型柱相連，加入 2ml 柱洗液，并用注塞輕推，使柱洗液進(jìn)入微型柱。

9. 取出微型柱置于 eppendorf 管中，離心 2 分鐘以除去微型柱中的柱洗液。

10. 將微型柱放在一個新 eppendorf 管中，加 50μl TE (或水) 于微型柱中，靜止 1 分鐘后，4℃下 12000g 離心 20 秒。

11. 丟棄微型柱，將 eppendorf 管中的質(zhì)粒 DNA 貯于 4℃或 - 20℃冰箱。

[注意] 樹脂使用前應(yīng)充分混勻，如有結(jié)晶，可將樹脂用 25-37℃水浴處理 10 分鐘。